中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所RNA系統(tǒng)生物學(xué)研究組王澤峰研究員和魏歡歡副研究員受邀在國家自然科學(xué)基金委主辦期刊《基礎(chǔ)研究》（Fundamental Research）“RNA生物學(xué)與治療”專題發(fā)表了題為：mRNA therapeutics: New vaccination and beyond 的綜述，探討了mRNA療法的最新進(jìn)展，展示了其在疫苗研究以及其他領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，并著重介紹了新一代環(huán)形mRNA技術(shù)，提供了預(yù)防性疫苗以外的mRNA療法的概述和展望。

在與疾病的斗爭中，人類傾向于向生命本身學(xué)習(xí)，并利用自然界提供的一切。從次級(jí)代謝物到大分子，從細(xì)胞到器官，這些生命成分都可以被設(shè)計(jì)并應(yīng)用于新的醫(yī)學(xué)治療。作為關(guān)鍵的大分子之一，信使RNA（mRNA）也有潛力被應(yīng)用于新的治療方法。mRNA療法的概念很簡單，它使用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA來指導(dǎo)體內(nèi)具有藥理活性的蛋白質(zhì)的翻譯。mRNA理論上幾乎可以產(chǎn)生任何功能性蛋白/多肽用于疫苗接種或蛋白替代療法。

然而，自從mRNA編碼藥物的概念被構(gòu)想出來以來，研究人員花費(fèi)了幾十年的時(shí)間和巨大的努力才最終成功地生產(chǎn)出商業(yè)產(chǎn)品。

COVID-19大流行期間，兩款新冠mRNA疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）的緊急使用授權(quán)凸顯了mRNA作為一種新型疫苗的潛力，并引領(lǐng)了mRNA療法的新時(shí)代。

與基于DNA和蛋白質(zhì)這兩種大分子的藥物相比，mRNA表現(xiàn)出一些非凡的優(yōu)勢。由于mRNA是蛋白質(zhì)翻譯的模板，基于mRNA的藥物在許多方面壓倒了蛋白質(zhì)藥物。具體而言，mRNA克服了外源表達(dá)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、折疊、裝配和定位的障礙。同時(shí)，它可以同時(shí)為由多個(gè)亞基組成的抗原編碼多個(gè)蛋白質(zhì)，解決了以正確的化學(xué)計(jì)量法重建蛋白質(zhì)亞基的挑戰(zhàn)。此外，mRNA的生產(chǎn)和制造比蛋白質(zhì)更快、更靈活、更方便，也更便宜，特別是作為在大流行期間快速篩選和開發(fā)疫苗產(chǎn)品的工具。另一方面，與DNA療法相比，mRNA不需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮功能，因此產(chǎn)生插入突變的風(fēng)險(xiǎn)可以忽略不計(jì)。此外，與DNA相比，mRNA具有瞬時(shí)活性，減少了對宿主穩(wěn)態(tài)構(gòu)成負(fù)擔(dān)的可能性。這些令人印象深刻的優(yōu)勢使mRNA療法成為最新但最有前途的治療策略，受到了研究界、資助機(jī)構(gòu)和生物醫(yī)學(xué)行業(yè)的極大關(guān)注。

盡管mRNA療法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了安全、可編程、靈活和具有成本效益的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，但mRNA的固有特性和其他技術(shù)限制帶來了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。三個(gè)主要挑戰(zhàn)是——表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)性、免疫調(diào)節(jié)和體內(nèi)靶向給藥。這些挑戰(zhàn)引起了研究人員的極大興趣，并付出了巨大的努力來尋找相應(yīng)的解決方案。

在這篇綜述中，王澤峰團(tuán)隊(duì)詳細(xì)介紹了基于mRNA的療法的進(jìn)展和挑戰(zhàn)，強(qiáng)調(diào)了有助于將mRNA技術(shù)擴(kuò)展到疫苗以外的創(chuàng)新和解決方案。

mRNA療法的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)

從應(yīng)用領(lǐng)域來看，當(dāng)前的mRNA療法可大致分為三類基本類型——針對傳染病的預(yù)防性疫苗、針對癌癥的治療性疫苗，以及作為直接免疫療法或其他蛋白質(zhì)藥物的蛋白替代藥物。

mRNA預(yù)防性疫苗的原理是將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA遞送到人體內(nèi)，翻譯出抗原蛋白，從而刺激免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵。免疫系統(tǒng)可識(shí)別mRNA產(chǎn)生的抗原蛋白，通過主要組織相容性復(fù)合體I（MHC I）激活能夠“殺死”感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+ T細(xì)胞），或通過MHC II和輔助T細(xì)胞（CD4+ T細(xì)胞）刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。

抗原編碼mRNA療法策略

隨著疫苗的不斷改進(jìn)，最近發(fā)生了范式轉(zhuǎn)變，不僅將疫苗用于疾病預(yù)防，而且還用于疾病治療。治療性疫苗的研究主要集中在癌癥領(lǐng)域，不僅由于癌癥的固有特點(diǎn)，還因?yàn)樽罱诎┌Y免疫治療領(lǐng)域的爆發(fā)和成功，包括免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）、嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）介導(dǎo)的治療，以及腫瘤特異性抗原。癌癥治療性疫苗的關(guān)鍵思路是使用腫瘤特異性抗原來訓(xùn)練人體免疫系統(tǒng)，從而高特異性殺死癌細(xì)胞。由于mRNA與DNA疫苗相比具有更高的免疫原性，能夠編碼多種抗原或具有多種表位的完整抗原，以及快速制造的能力，似乎具有巨大的潛力作為治療性疫苗，特別是作為癌癥疫苗來啟動(dòng)和放大抗癌免疫反應(yīng)。

對于癌癥疫苗，即使抗原可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制性的腫瘤微環(huán)境也可能阻止T細(xì)胞浸潤到腫瘤中，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。因此，治療性癌癥疫苗可能需要與其他療法（例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）相結(jié)合，以獲得更好的療效?？偟膩碚f，由于腫瘤免疫的復(fù)雜性，治療性癌癥疫苗的成功開發(fā)相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，在抗原選擇和臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面都需要進(jìn)一步優(yōu)化。

雖然每種mRNA療法都有其獨(dú)特的挑戰(zhàn)，但所有mRNA療法都面臨一些共同的挑戰(zhàn)。第一個(gè)挑戰(zhàn)是提高mRNA表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)時(shí)間。由于mRNA易被降解，導(dǎo)致RNA產(chǎn)品（特別是長RNA）的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本較高。此外，治療性疫苗和蛋白替代療法需要細(xì)胞中mRNA藥物的長表達(dá)時(shí)間，這可以通過提高mRNA的穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。

第二個(gè)挑戰(zhàn)是RNA的高固有免疫原性。外源性和配制的mRNA被各種固有免疫反應(yīng)識(shí)別時(shí)具有免疫刺激作用。在蛋白替代療法的應(yīng)用中，由于翻譯抑制和細(xì)胞毒性，固有免疫系統(tǒng)的激活是不希望發(fā)生的。Katalin Karikó 和 Drew Weissman 等人通過假尿苷修飾等方法來抑制RNA的免疫原性并促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，從而解決了這一問題。這項(xiàng)技術(shù)為mRNA的治療應(yīng)用做出了至關(guān)重要的貢獻(xiàn)。然而，這種核苷修飾相對昂貴，并在序列設(shè)計(jì)中增加了額外限制。

第三個(gè)挑戰(zhàn)是mRNA的體內(nèi)遞送。mRNA需要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)才能翻譯產(chǎn)生功能蛋白，但由于mRNA體積較大且?guī)щ姡y以穿過細(xì)胞膜的陰離子磷脂雙分子層，限制了mRNA在體內(nèi)表達(dá)目標(biāo)蛋白。為了獲得安全有效的mRNA細(xì)胞內(nèi)遞送，許多遞送系統(tǒng)得到了證實(shí)，其中脂質(zhì)納米顆粒（LNP）表現(xiàn)出了應(yīng)用潛力。但LNP的配方仍有很大的改進(jìn)空間，特別是mRNA的治療性疫苗和蛋白替代應(yīng)用需要細(xì)胞或組織特異性遞送，迫切需要進(jìn)一步開發(fā)合理的遞送系統(tǒng)。

在mRNA治療的關(guān)鍵步驟中，包括序列設(shè)計(jì)、mRNA合成和生產(chǎn)以及靶向給藥，都面臨著巨大挑戰(zhàn)。此外，研究人員已經(jīng)突破了線性mRNA藥物的限制，開發(fā)了環(huán)形RNA（circRNA）作為mRNA療法的替代模式，其能夠長期表達(dá)，求具有低免疫原性。它還提供了巨大的治療潛力，特別是在mRNA預(yù)防疫苗之外的蛋白替代療法中。

circRNA是共價(jià)閉合的單鏈RNA（ssRNA）分子，主要由pre-mRNA通過反式剪接產(chǎn)生。大多數(shù)circRNA源于編碼蛋白質(zhì)的基因，并包含完整的外顯子。此外，含有外顯子的circRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)?？偟膩碚f，circRNA雖然被歸類于非編碼基因，但其具有作為mRNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的潛力，相關(guān)研究也證實(shí)了外源性circRNA可以在體內(nèi)翻譯蛋白。一些研究題也表明，內(nèi)源性circRNA同樣可以翻譯蛋白。

circRNA的剪接與翻譯

circRNA分子的幾個(gè)特點(diǎn)使其成為新一代mRNA藥物的有吸引力的候選者，特別是作為蛋白替代療法。首先，circRNA比其同源線性mRNA具有更高的細(xì)胞穩(wěn)定性，可能是因?yàn)樗鼈冊隗w外對核酸外切酶的降解具有抵抗性，并且/或在體內(nèi)對免疫誘導(dǎo)的線性RNA衰變機(jī)制具有抵抗性。circRNA的第二個(gè)優(yōu)勢是，與線性RNA相比，純化的circRNA具有較低的免疫原性，這對于長期表達(dá)非常重要。

circRNA應(yīng)用的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是體外大規(guī)模生產(chǎn)。體外合成circRNA的常用方法可分為兩類：RNA連接酶介導(dǎo)的直接連接和核酶介導(dǎo)的自剪接。使用T4 RNA連接酶直接將線性前體RNA環(huán)化是多年前開發(fā)的經(jīng)典方法。這種方法可以生成無外源片段的circRNA，其免疫原性最小。然而，其通常需要輔助的夾板（splint）序列來完成環(huán)化。這種方法難以規(guī)?；a(chǎn)。此外，連接酶的使用將增加產(chǎn)品純化的復(fù)雜性，因此這種策略主要用于實(shí)驗(yàn)室研究。

circRNA也可以通過引入自催化的I類內(nèi)含子來產(chǎn)生，這些內(nèi)含子起環(huán)化酶核酶的作用。這種優(yōu)化的在真核生物中設(shè)計(jì)高效穩(wěn)定的circRNA翻譯的方法被稱為PIE（置換內(nèi)含子-外顯子），已被進(jìn)一步用于生產(chǎn)預(yù)防SARS-CoV-2的circRNA疫苗。但這種方法會(huì)在circRNA序列中留下了一個(gè)外來片段作為“疤痕”序列，這可能會(huì)扭曲circRNA的結(jié)構(gòu)，引發(fā)先天免，從而限制其作為蛋白替代療法的應(yīng)用?？其J邁德的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為Clean-PIE的方法，以生產(chǎn)免疫原性最小化的無疤痕circRNA。此外，王澤峰團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為CirCode的新方法，使用自剪接II類內(nèi)含子，以共轉(zhuǎn)錄的方式高效產(chǎn)生免疫原性低的無疤痕circRNA，且可以擴(kuò)展到大規(guī)模生產(chǎn)。由此產(chǎn)生的circRNA非常穩(wěn)定，可以延長在不同細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯的時(shí)間。

circRNA的生產(chǎn)不需要5′端帽子和堿基修飾步驟，從而顯著降低了生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本。但作為一種新療法，circRNA仍然存在獨(dú)特的技術(shù)障礙，包括高效環(huán)化和翻譯的序列設(shè)計(jì)，以及高效的體內(nèi)遞送。

為了改善藥理特性，mRNA的序列設(shè)計(jì)和合成在mRNA治療中至關(guān)重要。所有五個(gè)功能區(qū)域，包括5′端帽子、5′-UTR、編碼區(qū)（CDR）、3′-UT和poly(A)尾巴，都必須仔細(xì)設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)翻譯。

circRNA的設(shè)計(jì)應(yīng)集中在三個(gè)區(qū)域：自催化內(nèi)含子、IRES和ORF。一般來說，circRNA的ORF設(shè)計(jì)被認(rèn)為與線性mRNA相似，但無需堿基修飾。IRES是設(shè)計(jì)的重點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儾粌H影響circRNA翻譯效率，而且還具有通過結(jié)合組織特異性IRES反式作用因子（ITAF）來調(diào)節(jié)組織特異性表達(dá)的潛力。經(jīng)典的IRES主要來自病毒序列，并在circRNA模式中用于驅(qū)動(dòng)翻譯。然而，最近的研究表明，許多其他序列可以作為IRES類元件或調(diào)控元件來促進(jìn)IRES活性和刺激翻譯。因此，篩選和優(yōu)化宿主友好型和組織特異性的IRES對circRNA技術(shù)至關(guān)重要。此外，自催化內(nèi)含子被發(fā)現(xiàn)顯著影響循環(huán)效率，因此篩選和優(yōu)化高度活化的自催化內(nèi)含子也可能有助于circRNA藥物。

線性mRNA與circRNA藥物在生產(chǎn)流程中的比較

大分子RNA的體內(nèi)靶向遞送是近幾十年來mRNA療法領(lǐng)域的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。其中，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是目前唯一被批準(zhǔn)用于臨床的新冠mRNA疫苗的遞送系統(tǒng)，也是目前mRNA遞送最廣泛使用的方法，而其他許多遞送方法則處于實(shí)驗(yàn)室研究和臨床研究的階段。

通常，LNP由四種成分組成，包括可離子化脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇（PEG）-脂質(zhì)。這四種成分可以形成穩(wěn)定的納米顆粒，以封裝和保護(hù)易降解的mRNA。納米顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在內(nèi)吞體的酸性環(huán)境中帶正電荷，促進(jìn)隨后的mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。然而，LNP制備的mRNA傾向于在肝臟中積累，可能是因?yàn)檩d脂蛋（ApoE）與LNP結(jié)合，然后由ApoE受體介導(dǎo)攝取到肝細(xì)胞。大多數(shù)LNP-mRNA藥物在靜脈注射給藥后集中在肝臟和脾臟中，少量在脂肪組織中。在肌內(nèi)注射的情況下，mRNA藥物的表達(dá)主要見于肝臟、肌肉和淋巴結(jié)。

此外，LNP除肝臟外的器官遞送可以通過修改脂質(zhì)組成來實(shí)現(xiàn)，其中包括調(diào)整脂質(zhì)特性和/或脂質(zhì)比例。LNP成分可以顯著影響細(xì)胞內(nèi)遞送效率，決定遞送的細(xì)胞特異性，并調(diào)節(jié)免疫原性。例如，在LNP中添加SORT脂質(zhì)改變了LNP在體內(nèi)的器官靶向性，實(shí)現(xiàn)了mRNA向其他器官和組織的遞送。此外，還可以通過調(diào)整LNP組分的化學(xué)計(jì)量來實(shí)現(xiàn)靶向遞送。還有研究顯示，通過對合成脂質(zhì)納米顆粒庫的體內(nèi)篩選，簡單改變LNP的頭部結(jié)構(gòu)，mRNA可以被導(dǎo)向不同的肺部亞細(xì)胞類型。

自20世紀(jì)90年代概念驗(yàn)證以來，mRNA療法經(jīng)歷了漫長的發(fā)展路徑，先后克服了幾個(gè)主要的技術(shù)困難，包括穩(wěn)定性差、先天免疫和遞送問題。而新冠大流行的壓力在最終將這一新技術(shù)變成現(xiàn)實(shí)方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，這反過來為這種新藥物模式的其他應(yīng)用鋪平了道路。盡管取得了早期成功，但該領(lǐng)域仍存在許多技術(shù)挑戰(zhàn)，目前正在進(jìn)行深入研究。新的RNA平臺(tái)技術(shù)，包括circRNA和saRNA，以及新的遞送方法的發(fā)展，可能會(huì)將mRNA療法擴(kuò)展到新的前沿，例如細(xì)胞的體內(nèi)編程。此外，為mRNA療法開發(fā)的方法可能會(huì)對未來的RNA藥物，包括長鏈非編碼RNA（lncRNA）療法，有所幫助。