堿基編輯技術(shù)

堿基編輯技術(shù)（BEs）克服了核酸酶編輯技術(shù)的許多限制，通過基因組DNA中的單核苷酸替換實(shí)現(xiàn)精確的基因校正，而且不需要形成DNA雙鏈斷鏈。BEs由融合到可編程DNA結(jié)合域的DNA修飾酶組成，最早的BEs是胞嘧啶堿基編輯（CBEs），能靶向C、G替換為T、A，完成突變堿基的修復(fù)。

引導(dǎo)編輯技術(shù)

雖然BEs可以糾正大多數(shù)遺傳疾病中的單核苷酸突變，但卻不能進(jìn)行多個單核苷酸的替換，也不能介導(dǎo)基因靶向插入或刪除。而引導(dǎo)編輯技術(shù)（PEs）可對多個單核苷酸進(jìn)行替換，介導(dǎo)基因靶向插入或刪除，并且不會產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。PEs由融合到Cas9切口酶結(jié)構(gòu)域的逆轉(zhuǎn)錄酶組成，并使用工程化的引物編輯向?qū)NA（PegRNA）將Cas9切口酶引導(dǎo)到特定的靶點(diǎn)，對感興趣的特定堿基進(jìn)行編碼。

圖1. 三類治療性的基因編輯工具

體內(nèi)基因編輯遞送系統(tǒng)的基本特征

成熟的體內(nèi)基因編輯遞送系統(tǒng)需要克服裝載基因的細(xì)胞內(nèi)遞送和其他的生物障礙?？偟膩碚f，成熟的體內(nèi)基因編輯遞送系統(tǒng)必須有以下特征：（1）在進(jìn)入細(xì)胞之前裝載的目的基因必須完整不被破壞；（2）能結(jié)合特定的細(xì)胞；（3）能穿越靶細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中；（4）將其裝載的基因在細(xì)胞內(nèi)釋放出來。

圖2. 體內(nèi)基因編輯遞送系統(tǒng)的基本特征

病毒載體遞送

目前全球有1000多項臨床試驗使用病毒載體將目的基因遞送到人體特定的細(xì)胞中，臨床上大多數(shù)體內(nèi)基因編輯都使用腺相關(guān)病毒（AAV），少數(shù)研究使用慢病毒或腺病毒。

圖3. 三種不同的病毒載體遞送方式

AAV遞送

AAV目前是遞送DNA分子治療藥物中最受歡迎的病毒載體，具有良好的安全性，高度生物相容性以及較低的免疫反應(yīng)。此外，自然條件下不同血清型的AAV衣殼感染不同組織在偏好性上也不盡相同。目前運(yùn)用于臨床的AAV主要是自然條件的AAV，工程化或定向進(jìn)化的AAV目前很少能進(jìn)入臨床。

雙AAV策略表達(dá)大片段基因

傳統(tǒng)上AAV包裝能力較弱，為了解決AAV的包裝限制，研究人員將編輯的基因分成兩部分，使每一部分都可以單獨(dú)包裝成AAV載體。然后這兩個AAV載體同時注射，在兩個AAV共同感染的細(xì)胞中，全長的基因可通過在DNA、mRNA前體或蛋白質(zhì)水平上的相互作用機(jī)制重組。

較小的Cas實(shí)現(xiàn)單AAV載體遞送

單AAV載體遞送可減少實(shí)現(xiàn)基因編輯所需的AAV總的病毒劑量，根據(jù)PAM序列的不同，Cas9分為SpCas9（來自化膿性鏈球菌，基因大小為4.1kb，可識別的PAM序列為NGG）和SaCas9（來自金黃色葡萄球菌，基因大小為3.2kb，可識別的PAM序列為NNGRRT）兩種。因此，SaCas9可與一個或兩個sgRNA共同裝載到單個AAV載體中。目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)單AAV載體的SaCas9核酸酶敲除Pcsk9并降低小鼠的血清膽固醇。

減少AAV遞送后編輯基因的長期表達(dá)

AAV遞送最大局限性之一是無法控制其在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)時長。由于AAV基因組可整合到細(xì)胞核，因此遞送的基因會長期表達(dá)。而此類編輯基因的長期表達(dá)，會增加其他類型的非靶標(biāo)基因被編輯的風(fēng)險。此外，Cas9的長期表達(dá)還會引發(fā)免疫反應(yīng)。為了解決這個問題，目前已經(jīng)開發(fā)出自我失活的AAV載體的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)針對Cas9酶的引導(dǎo)RNA，將隨機(jī)缺失引入AAV基因組，只要編輯程序被表達(dá)，隨著時間的推移，表達(dá)的編輯程序?qū)Щ睢?/p>

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送

LNP遞送作為體內(nèi)基因編輯的非病毒載體方式越來越受到科學(xué)界的歡迎。LNP主要用于運(yùn)輸核酸物質(zhì)，包括siRNAs和治療性mRNAs。為了將其包裹的核酸物質(zhì)運(yùn)送到靶細(xì)胞，LNP首先通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在內(nèi)體酸化后通過破壞內(nèi)體膜分泌出來。LNP通常由四種成分組成：陽離子或可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、聚乙二醇（PEG）-脂質(zhì)和膽固醇。通過改變成分可以產(chǎn)生具有不同性質(zhì)的LNP。目前LNP已被美國FDA批準(zhǔn)用于通過靜脈注射向人的肝細(xì)胞輸送治療性siRNA。

圖4. 脂質(zhì)納米顆粒遞送

用于肝臟遞送的LNP

大多數(shù)靜脈注射的LNP會在肝臟中積累，因為許多LNP在血液中被ApoE脂蛋白包裹，血液流經(jīng)肝細(xì)胞時通過ApoE和肝細(xì)胞的LDL（低密度脂蛋白）受體相互作用被肝細(xì)胞攝取，因此LNP最常見的用途是將治療性核酸物質(zhì)運(yùn)送到肝臟。通過調(diào)整LNP的配方能夠有效地包裹不同類型的核酸物質(zhì)，如mRNAs、siRNAs。通過優(yōu)化LNP的脂質(zhì)配方，可以將SpCas9核酸酶的mRNA遞送到小鼠肝臟。編碼SpCas9的mRNA經(jīng)過化學(xué)修飾，可提高mRNA的穩(wěn)定性，并減少細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)。

用于非肝臟遞送的LNP

由于靜脈注射的LNPs存在較強(qiáng)的肝臟自然積累效應(yīng)，要開發(fā)出LNP介導(dǎo)的非肝臟的基因編輯靶向遞送系統(tǒng)存在較大的挑戰(zhàn)性。目前非肝臟遞送的LNPs的策略之一，就是通過局部注射替代傳統(tǒng)的靜脈注射。目前通過局部注射脂質(zhì)包裹的LNPs，成功在小鼠內(nèi)耳和視網(wǎng)膜中進(jìn)行核酸酶編輯和堿基編輯。目前許多實(shí)驗室致力于開發(fā)非肝臟遞送的LNPs，其中包括已經(jīng)實(shí)現(xiàn)選擇性器官靶向（SORT）的LNP，該方案是通過添加額外的帶電荷脂質(zhì)成分來調(diào)節(jié)顆粒的內(nèi)部電荷，發(fā)現(xiàn)這種額外成分的電荷和濃度足以將LNP引導(dǎo)到肺或脾，而不會影響小鼠的肝臟。

?病毒樣顆粒（VLP）遞送

VLP被認(rèn)為是富有前景的藥物遞送載體。VLP是由攜帶分子貨物的病毒蛋白組成的小型結(jié)構(gòu)，但不包含病毒的遺傳物質(zhì)，也不會引起感染。由于VLP缺乏病毒的遺傳物質(zhì)，它們可能比其他使用實(shí)際病毒的遞送方法更安全。

裝載mRNA的VLP

在VLP中裝載mRNA依賴于特定的分子機(jī)制，通過該機(jī)制，mRNA可以被病毒衣殼蛋白識別，并隨后被整合到病毒顆粒中。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組包含一個包裝信號Ψ，該信號直接將病毒RNA包裝成病毒顆粒，因此，設(shè)計成包含Ψ的mRNA也同樣可以被整合到病毒顆粒中。

裝載功能蛋白或RNPs（核糖核蛋白）的VLP

VLP中裝載功能蛋白或RNP需要一種在VLP形成時將目標(biāo)蛋白質(zhì)定位到VLP中的策略。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員將所需的目標(biāo)蛋白與病毒結(jié)構(gòu)蛋白（gag）融合，這一策略在衣殼自組裝過程中將目標(biāo)蛋白導(dǎo)向病毒顆粒。在大多數(shù)情況下，Gag和目標(biāo)蛋白由一個短肽序列連接在一起，該序列在病毒顆粒成熟后被共包裹的病毒蛋白酶切割，使目標(biāo)蛋白能夠釋放到感染細(xì)胞中。這種方法已被用于在VLP內(nèi)裝載各種不同功能的蛋白，類似的策略也用來將Cas9核酸酶蛋白包裝到VLP中。

圖5. 病毒樣顆粒遞送

展望和結(jié)論

在人類體內(nèi)進(jìn)行治療性基因編輯的時代已經(jīng)到來。CRISPR-Cas技術(shù)的廣泛開發(fā)和優(yōu)化已經(jīng)產(chǎn)生了強(qiáng)大的基因編輯工具，包括核酸酶編輯、堿基編輯和引導(dǎo)編輯。將這些基因編輯工具與有效的體內(nèi)遞送方案（病毒載體、LNP和VLP）相結(jié)合治療疾病，已經(jīng)從動物模型的概念驗證應(yīng)用到人類的臨床治療中。在目前的體內(nèi)給藥方式下，基因編輯技術(shù)可以很容易地通過靜脈注射輸送到肝臟細(xì)胞，或通過眼內(nèi)注射輸送到視網(wǎng)膜細(xì)胞，治療一系列肝臟或眼科的遺傳性疾病。隨著更多體內(nèi)基因編輯療法的開發(fā)，以及未來基因遞送技術(shù)的進(jìn)步，將為臨床治療不同器官的遺傳性疾病提供可靠的途徑和堅實(shí)的基礎(chǔ)。

參考資料

[1]Raguram A, Banskota S, Liu DR. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell. 2022 Jul 21;185(15):2806-2827. doi: 10.1016/j.cell.2022.03.045.

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